Avaliação do método: Análise de fosfatidiletanol (PEth) no sangue total humano por LC-MS / MS
O método estabelecido neste estudo fornece uma análise precisa do fosfatidiletanol (PEth) usando um procedimento simples de precipitação de proteínas e um rápido gradiente de 3,5 minutos em LC-MS / MS. Análise específica e sensível de PEth 16: 0/18: 1 no sangue total foi obtida devido à seletividade e retenção únicas da coluna Raptor FluoroPhenyl.
O fosfatidiletanol (PEth) é um grupo de fosfolipídios formado por uma reação enzimática entre etanol e fosfatidilcolina nas membranas celulares. Entre os múltiplos homólogos de PEth, PEth-16: 0/18: 1 (ácido palmítico / ácido oleico) (Figura 1) é a molécula predominante extraída de eritrócitos humanos e pode ser medida no sangue total como um biomarcador específico de consumo de álcool com uma janela de detecção de até 3-4 semanas. Anteriormente, o PEth era considerado um biomarcador para alto consumo sustentado de álcool, mas com a aplicação de técnicas altamente sensíveis de LC-MS / MS, agora é possível usar a concentração de PEth no sangue para diferenciar o consumo crônico do social, ou usá-lo como um marcador de absoluta abstinência. Neste estudo, uma análise cromatográfica rápida foi desenvolvida usando uma coluna Raptor FluoroPhenyl.
Figura 1: Estrutura de PEth-16: 0/18: 1
Experimental
Padrões de calibração e amostras de controle de qualidade
O sangue total humano livre de PE e em conjunto (BioIVT) foi fortificado com PEth-16: 0/18: 1 (RedHot Diagnostics AB) para preparar padrões de calibração e amostras de CQ. As faixas de linearidade foram de 0,025 a 4,0 µM (18 a 2810 ng / mL). Três níveis de QC foram preparados a 0,075, 0,75 e 2,5 µM. As amostras padrão fortificadas e QC foram submetidas ao seguinte procedimento de preparação de amostras.
Preparação de amostra
Utilizando um procedimento de preparação de amostras descrito pela RedHot Diagnostics, a amostra de sangue (50 µL) foi misturada com 50 µL de padrão interno (0,4 µM de PEth-d5 em 2-propanol) e 150 µL de 2: propanol: tetra-hidrofurano 4: 1. A mistura foi agitada no vórtex durante 20 segundos a 3000 rpm e centrifugada durante 10 minutos a 4300 rpm. O sobrenadante foi injetado para análise.
Condições do instrumento
A análise por LC-MS / MS de PEth no sangue total humano foi realizada em um Waters ACQUITY UPLC acoplado a um sistema Xevo TQ-S MS / MS. As condições do instrumento foram as seguintes e as transições do analito são fornecidas na Tabela I.
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Coluna analítica: |
Raptor FluoroPhenyl 2,7 µm, 50 mm x 2,1 mm ( ref. 9319A52 ) |
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Fase móvel A: |
Água, acetato de amônio 5 mM |
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Fase móvel B: |
9: 1 Metanol: 2-propanol |
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Gradiente: |
Tempo (min)% B |
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0,00 70 |
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1,00 80 |
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2,00 80 |
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2,50 100 |
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2,51 70 |
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3,50 70 |
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Quociente de vazão: |
0,5 mL / min |
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Volume de injeção: |
2 µL |
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Temp da coluna: |
40 ° C |
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Modo de íon: |
ESI negativo |
Tabela I: Transições do Analyte
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Composto |
Íon precursor |
Quantificador de íons do produto |
Qualificador de íons do produto |
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PEth-16: 0/18: 1-d5 |
706,6 |
281,3 |
- |
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PEth-16: 0/18: 1 |
701,5 |
255,3 |
281,3 |
Resultados e discussão
Desempenho cromatográfico
Uma análise cromatográfica rápida de 3,5 minutos (Figura 2) foi alcançada com injeção de sobrenadante após um procedimento simples de precipitação de proteínas. A análise específica e sensível do fosfatidiletanol 16: 0/18: 1 no sangue total foi obtida devido aos mecanismos exclusivos de seletividade e retenção da coluna Raptor FluoroPhenyl. Não foi observada transferência da análise do sangue em branco injetado imediatamente após o padrão de concentração mais alto (Figura 3). Desempenho cromatográfico consistente (retenção, formato do pico e sensibilidade) foi observado em 500 injeções contínuas, demonstrando uma boa robustez do método (Figura 4).
Figura 2: Sangue total humano fortificado a 0,5 µM
Figura 3: Sangue inteiro humano em branco
Figura 4: Análise robusta de fosfatidiletanol em uma coluna Raptor FluoroPhenyl (sangue total a 0,5 µM)
Linearidade
Usando regressão linear ponderada de 1 / x, PEth-16: 0/18: 1 mostrou linearidade aceitável com valores de r 2 de 0,999 ou mais e desvios em% das concentrações nominais de <10% (Figura 5). O limite de quantificação estabelecido foi de 0,025 µM (~ 18 ng / mL) no sangue.
Figura 5: Curva padrão
Exatidão e precisão
Análises de precisão e exatidão foram realizadas em três dias diferentes. A precisão do método foi demonstrada pelos valores de recuperação situando-se dentro de 5% da concentração nominal para todos os níveis de CQ. O% RSD foi de 0,117-1,33% e 2,30-5,08% para intradia e interdia, respectivamente, indicando precisão aceitável do método (Tabela II).
Tabela II: Exatidão e precisão de amostras de CQ para análise de PEth
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QC-1 (0,0750 µM) |
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